C4反相色譜柱的影響因素：

　　(1)柱長

　　有機(jī)小分子和肽類的分辨率隨柱長的增加而增加．但是柱長增加并不能使蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率顯著增加．它們在較短的柱子上往往也有很好的分離效果。

　　(2)流動相的流速。

　　有機(jī)小分子和肽類的分辨率對流動相流速非常敏感。而蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率則不然。流速越小，柱子越長，色譜峰的寬度就越大，分辨率就越小。制備色譜上樣過程中的流速對動態(tài)吸附容量影響很大。

　　(3)溫度。

　　溫度上升，流動相黏度下降，流動速度加快，且流動相與固定相之間的傳質(zhì)速度加快，使分辨率增加。同時，溫度上升，分子熱運(yùn)動增加，疏水性作用減弱。升高溫度要考慮目標(biāo)物質(zhì)的熱穩(wěn)定性。

　　(4)流動相組成。

　　流動相的極性越大，溶質(zhì)的分配系數(shù)越大，洗脫時間越長。RPC多采用降低流動相極性(水含量)的線性梯度洗脫法。水是極性醉強(qiáng)的溶劑，在反相色譜中常常和基礎(chǔ)溶劑配合使用，向流動相中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機(jī)溶劑，以得到不同強(qiáng)度的流動相，這些有機(jī)溶劑稱為修飾劑。反相色譜中常用的有機(jī)溶劑有甲醇和乙腈。此外，乙醇、四氫呋南、異丙醇及二氧六環(huán)也常被用作修飾劑。有機(jī)溶劑梯度的大小也會影響分辨率，一般梯度越小，分辨率越大。